Ze zeleného univerzitního kampusu v Praze-Suchdole je to jen 20 minut autem a přívozem do Výzkumného ústavu včelařského, s. r. o., v Dole a samozřejmě mají tyto dvě instituce k sobě blízko.
Výuka včelařství
Na Fakultě agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů České zemědělské univerzity, které nikdo neřekne jinak než „Agro“, působí Ing. Dalibor Titěra, CSc., z dolského Výzkumného ústavu včelařského a vzdělává studenty v oblíbeném předmětu Včelařství. O školní včelín pečuje mikrobiolog prof. Ing. Karel Voříšek, CSc., který včelaření přibližuje zájemcům z univerzity třetího věku a zahraničním studentům přijíždějícím na výměnné programy.
Včelám se zde věnuje také několik skupin vědců. Jednu z nich vede doc. Ing. Jaroslav Havlík, Ph.D., sám aktivní včelař. Skupina je úzce propojena se zmíněným Výzkumným ústavem včelařským, kromě Dalibora Titěry s Dr. Martinem Kamlerem. Dále s týmem doc. RNDr. Pavla Hyršla, Ph.D., z Masarykovy univerzity v Brně a s Mgr. Jiřím Danihlíkem, Ph.D., z katedry biochemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci. Tyto týmy řešily společně v různých obměnách řadu projektů zaměřených na včelí biologii a mikrobiologii, přičemž hlavním tématem jejich spolupráce je dlouhověkost zimní generace.
Skupinku apidologů na Agru reprezentovali v průběhu let doktorandi Jaroslav Flesar, Zuzana Hroncová a nyní Byeol Lee, vedení Jaroslavem Havlíkem. Dále pak řada diplomantů a bakalářů. Do skupiny patří vynikající včelí mikrobiolog, doc. Ing. Jiří Killer, Ph.D., který popsal zcela nové mikroorganismy v trávicím traktu včel. Jeho práce citují světově významní vědci v oboru. Výzkum skupina orientovala hlavně na využití antimikrobiálních látek z rostlin proti moru včelího plodu, mikrobiální osídlení včelího trávicího traktu, dlouhověkost u zimní generace včel a výzkum včelích probiotik.
Sanguinarin
Toto slovo bylo v roce 2010 naší vstupenkou do světa včel a včelařství. Jako chemiky a biology nás v té době zajímaly antibiotické vlastnosti přírodních látek a napadla nás spojitost se včelami.
V USA se proti moru včelího plodu používalo antibiotikum oxytetracyklin, jehož použití ale naše legislativa odmítla. To byl správný přístup, neboť antibiotika by potlačila klinickou fázi nemoci, ale mor by se nekontrolovaně šířil dál. Rostliny v listech, stoncích, nektaru vytvářejí škálu chemických sloučenin, pomocí nichž se samy brání bakteriím a houbám. Zajímavé je, že jsou často v malých koncentracích přítomné v nektaru a včely dokonce nektar s obsahem těchto přírodních antibiotik vyhledávají1. Shromáždili jsme velkou sbírku přírodních látek s předpokládanými antibiotickými účinky a otestovali je v laboratoři na účinek proti moru. Řada z nich měla v testech silný baktericidní účinek2, 3.
Ty nejslibnější jsme otestovali ve spolupráci s Výzkumným ústavem včelařským na senzorickou přijatelnost pro včely a v medocukrovém těstu je podali do oplodnáčků. Bylo překvapením, že zatímco tymol nebo chmelový extrakt včely nechtěly příliš přijímat, jedna látka zmizela z oplodnáčků dokonce dříve než samotné medocukrové těsto použité ke srovnání – sanguinarin (obr. 2). Tento přírodní alkaloid je obsažen v okrasné a léčivé makovité rostlině okecku srdčitém (Macleaya cordata) rostoucí v Číně. Včely pyl z této rostliny sbírají a jejich med pak sanguinarin obsahuje.
V průběhu let jsme se na tuto látku zaměřili, stanovili jsme její toxicitu pro dospělé včely i larvy a ta byla přijatelná (obr. 3 a, b). Od té doby byl sanguinarin sloučeninou, kterou jsme u včel podrobně prozkoumali. Zjistili jsme, že pokud je sanguinarin podán v úlu včelám jako extrakt v medocukrovém těstu, dosáhne ve střevech pětidenních larviček koncentrace dostatečné pro antimikrobiální účinek proti vegetativním buňkám moru včelího plodu, nikoli proti sporám. Včely tuto sloučeninu obecně dobře snáší. Zlepšovala se imunitní odpověď kukel4, mírně, i když ne zcela průkazně, se zvyšovala snůška medu ve třech testovaných úlech ve srovnání s kontrolními. Protože na snůšku má vliv řada faktorů, je těžké tento poznatek experimentálně prokázat.
Sanguinarin si našel cestu i na trh a stal se z něj úspěšný produkt známý jako Masamaril. Včelaři ho používají v rámci metodiky očisty včelstev pomocí prostředku Beesafe, ale i samostatně.
Mikroby – obyvatelé včelích střev
Trávicí soustava včely má tři části, a to stomodeum, což jsou ústní otvor, hltan, jícen a medný váček, mesenteron neboli žaludek a proctodeum složený ze střeva a výkalového vaku. Pozoruhodné je, že včely mají trávicí trakt osídlen bakteriemi, podobně jako savci včetně člověka. Symbiotická mikrobiota je charakteristická pro společenský hmyz, jako jsou včely a čmeláci. Jiný hmyz, například mouchy, tuto vlastnost nemají.
Každá část trávicího traktu má své bakterie zajišťující včele celou řadu procesů, imunitních pochodů, které včelí organismus sám nezvládá. Vytvářejí hormony, pomáhají štěpit bílkoviny nebo složité cukry, metabolicky mění pesticidy a snižují tak jejich škodlivost. Paleta služeb, které tak pro včelu vykonávají, je široká.
Hlavní druhy těchto mikroorganismů osídlují trávicí trakt všech včel celého světa, u včely medonosné kraňské, včely východní i včely obrovské. Z toho vyplývá, že včely a mikroorganismy se vzájemně sžily již v raných dobách evoluce a správné bakterie jsou pro včely velice významné. V naší výzkumné skupině jsme zjistili, které kmeny jsou významné pro jednotlivá vývojová stadia včel5.
Jedná se o několik druhů laktobacilů, bifidobakterie, gammaproteobakterie a alfabakterie. Složení mikrobioty se mění při přechodu z larvy na kuklu a na dospělce. U kukly se do té doby tvrdilo že trávicí trakt je v podstatě sterilní, ale my jsme u něho změny s pomocí metody qRT PCR přítomnost bakterií detekovali.
Mnohdy máme tendenci pohlížet na včelí dělnice jako na uniformní tvory, kopie jedné. Víme sice, že mají v průběhu života různé role, ale neuvědomujeme si, že mezi dvěma jednotlivými dělnicemi je rozdíl podobný jako mezi dvěma lidmi, mohou mít jiné chutě a pravděpodobně mají v úlu i svoje blízké přítelkyně. V analýze mikrobiálního osídlení střeva deseti podobně starých mladušek jsme zjistili, že každá z nich je individualita a každá má mikrobiální složení charakteristické pro ni samotnou6. Když jsme se snažili tento jev vysvětlit, zjistili jsme, jak složité vztahy v úlu panují. Včelí dělnice jsou vzájemně sestry, ale vzhledem k tomu, že se matka páří při snubním letu s několika trubci, jen část z nich má stejného otce a jsou tedy „supersestry“. Supersestry mají v úlu více kontaktů a mnohem častěji krmí jedna druhou. V úlu tak fungují spletité vztahy a také cest potravy, kterou si včely v úlu předávají z úst do úst, může být v procesu zvaném trofalaxe několik. Zřejmě z tohoto důvodu jsme zjistili, že stejně staré včely, i přes podobný genetický základ, mohou mít velmi rozmanitou střevní mikrobiotu.
Nukleární magnetická rezonance
Nukleární magnetická rezonance je metoda, kterou znají spíše chemici a využívají ji k určování struktury molekul (obr. 4). Na našem pracovišti tuto metodu využíváme na tzv. metabolomiku, což je chemická analýza poskytující přehled o malých molekulách v biologickém vzorku, tkáni, hemolymfě, trávicím traktu. Tato informace je důležitá, protože ukazuje momentální zapojení různých metabolických drah v organismu. Jsme tedy schopni říct, že se organismus soustředí na výstavbu proteinů, anebo naopak, že se zaměřuje na odbourávání cukrů, či je ve stresu, nebo se připravuje na klidové zimní období.
Metabolomika tak vidí procesy, které se dějí uvnitř buněk nebo v hemolymfě. Teoreticky dokáže poskytnout informaci o tom, zda je včelstvo připravené na zimu, zda podaná potrava nebo vysoká přítomnost roztoče Varroa nezvyšuje stres. V našem výzkumu s pomocí nukleární magnetické rezonance zkoumáme faktory, které odlišují dlouhověkou zimní generaci od generace letní. Zimní generace musí být zdravá, aby bylo včelstvo schopné přečkat zimu, čelit přitom roztoči a omezenému příjmu energie a zajistit brzký rozvoj včelstva.
Pro výzkum rozdílů metabolismu zimní a letní generace včel úlu jsme odebrali mladušky stejného stáří ze zakladeného plástu umístěného v laboratorním termostatu. Odebírali jsme je ve chvíli, kdy se líhly z buněk ven. Tento odběr jsme zopakovali v červnu a na podzim, kdy v úlu převažuje zimní generace.
Mezi včelami v létě a zimě je velký rozdíl7. Zimní včely mají více aminokyseliny prolinu a více trehalózy. Trehalóza je pro včelu to, co glukóza pro savce a je to hlavní cukr hemolymfy. Podobně prolin je hlavní aminokyselinou. Dohromady zřejmě tvoří v tělech zimních včel něco jako nemrznoucí směs. Vyšší hladina cukrů dále působí jako větší rezerva pro období nedostatku. Pozorovali jsme i další změny. Cholin se přesunuje z volné formy přítomné v hemolymfě do vázané formy v tukovém tělesu. Před zimou také výrazně klesá koncentrace volných aminokyselin. Přikrmování včel pylem nebo bílkovinnými doplňky na podzim je tedy nežádoucí, protože pokles aminokyselin, s výjimkou prolinu, je přirozeným procesem přípravy na zimu. Sledovali jsme tyto metabolické změny u včel v průběhu celého roku a potvrdili jsme je i v jiných experimentech.
Včely a probiotika
Bakterie jsou pro včely nesmírně významné, protože ovlivňují imunitu svého hostitele a příjem živin, i náchylnost jednotlivce k nemocem. Proto si vědci pohrávají s myšlenkou, zda je možné mikrobiální populaci, tzv. mikrobiom, pozitivně ovlivnit například podáním kmenů bakterií s ověřenými dobrými vlastnostmi. Teoreticky to možné je a je to cílem našeho současného výzkumu.
Ze včel jsme izolovali řadu laktobacilů, bifidobakterií a kmeny gramnegativní proteobakterie u včel dominující – Gilliamella apicola. Tyto kmeny jsme ve spolupráci s týmem Pavla Hyršla podrobili řadě testů (obr. 5 a, b, 6 a, b). Ověřujeme například jejich schopnost inhibovat růst Paenibacillus larvae, dále jejich vliv na imunitu a antimikrobiální aktivitu hemolymfy jako jeden z klíčových parametrů imunity. Využíváme nukleární magnetickou rezonanci a sekvenaci příští generace k tomu, abychom otestovali schopnost těchto kmenů kolonizovat včelí trávicí trakt a pozitivně ovlivňovat včelí metabolismus.
Věnujeme se také technologickým podmínkám nutným pro jejich vysušení do formy, v níž je bude možné podávat. Předběžné výsledky jsou slibné. Věříme, že na konci výzkumu se podaří na trh uvést skutečně ověřený a účinný preparát.
Milým překvapením je fakt, že pro aplikaci pěstujeme tyto bakterie v médiu, které je zcela z potravinářských surovin a po zfiltrování bakterií chutná jako zajímavá limonáda, která v sobě obsahuje celý tento podivuhodný příběh včel a jejich bakterií. Ministerstvu zemědělství patří díky za financování tohoto výzkumu prostřednictvím projektů QK21010088 a QJ1610248.
Výhledy do budoucna
Sílu našeho týmu vidíme v těsném spojení s Výzkumným ústavem včelařským v Dole v silném analytickém zázemí. Např. použití metody nukleární magnetické rezonance je ve výzkumu včel zcela ojedinělé. Metoda je schopná diagnostikovat stav včelstva na základě mnoha parametrů. Věříme, že se nám podaří ve spolupráci s ostatními týmy v České republice a v zahraničí s pomocí této metody ještě učinit mnohé objevy. Také se chceme dále zabývat vztahy bakterií a včel, a i zde nás čeká spousta práce. Rádi přivítáme v našich řadách nové zájemce o doktorské studium.
Publikace týmu Jaroslava Havlíka:
1. Hroncová Z., Havlík J., Stanková L., Hájková S., Titěra D., Rada V. Repellence and attraction of Apis mellifera foragers by nectar alkaloids. Sci. Agric. Bohem. 2016, 47, 14–17, doi:10.1515/SAB-2016-0003.
2. Kloucek P.; Smid J.; Flesar J.; Havlik J.; Titera D.; Rada V.; Drabek O.; Kokoska L. In vitro Inhibitory Activity of Essential Oil Vapors against Ascosphaera apis: https://doi.org/10.1177/1934578X1200700237 2012, 7, 253–256, doi:10.1177/1934578X1200700237
3. Flesar J., Havlik J., Kloucek P., Rada V., Titera D., Bednar, M., Stropnicky, M., Kokoska, L. In vitro growth-inhibitory effect of plant-derived extracts and compounds against Paenibacillus larvae and their acute oral toxicity to adult honey bees. Vet. Microbiol. 2010, 145, 129–133.
4. Hyrsl P., Dobes P., Vojtek L., Hroncova Z., Tyl J., Killer J. Plant alkaloid sanguinarine and novel potential probiotic strains Lactobacillus apis, Lactobacillus melliventris and Gilliamella apicola promote resistance of honey bees to nematobacterial infection. Inst. Anim. Physiol. Genet. v.v.i., Acad. Sci. Czech Repub. 2017, 70, 31–38.
5. Hroncova Z., Havlik J., Killer J., Doskocil I., Tyl J., Kamler M., Titera D., Hakl J., Mrazek J., Bunesova V. et al. Variation in Honey Bee Gut Microbial Diversity Affected by Ontogenetic Stage, Age and Geographic Location. PLoS One 2015, 10, e0118707, doi:10.1371/JOURNAL.PONE.0118707
6. Hroncova Z., Killer J., Hakl J., Titera D., Havlik J. In-hive variation of the gut microbial composition of honey bee larvae and pupae from the same oviposition time. BMC Microbiol. 2019, 19, 1–8, doi:10.1186/S12866-019-1490-Y/TABLES/1
7. Lee S., Kalcic F., Duarte I. F., Titera D., Kamler M., Mrna P., Hyrsl P., Danihlik J., Dobes P., Kunc M. et al. 1H NMR Profiling of Honey Bee Bodies Revealed Metabolic Differences between Summer and Winter Bees. Insects 2022, Vol. 13, Page 193 2022, 13, 193, doi:10.3390/INSECTS13020193
